1、抗原、抗体浓度的选择
以分别固定抗原含量与抗体浓度的方法，选取最小抗原量与最低抗体浓度，在免疫电泳后能出现最清晰项端狭窄且尖的锥形沉淀峰，长达2～5cm者为标准。一般抗原用量为0.5～5微克，抗血清用量为5～10微升，稀释度于1：10～1：200之间进行选择。
2、预复琼脂玻板的制备
将溶化的1%预复琼脂用滴管加玻板上，使之能将表面覆盖即可，放于温箱内干燥（或自然干燥），即可用以制备凝胶板。
3、抗血清琼脂板制备
根据上述选择结果，取一定量抗血清与一定量融化并冷却至56℃的1.5%巴比妥缓冲琼脂混合，使抗血清的浓度为以上述方法选择出的最适浓度，浇制抗血清琼脂板。琼脂厚度为1～2mm，玻板大小可根据实验所需而确定。如用5×7.5cm大小玻板时，约需抗血清琼脂6ml.
4、打孔、加样
待琼脂凝固后，于距玻板一长边10mm处，以3mm孔径打孔器打孔一排，孔距5mm.于各孔中加入抗原液，每孔10微升。每次实验中应加入几个不同浓度的标准抗原以作对照。稀释范围包括标本含量的最高与最低水平。
5、电泳
将琼脂板置于电泳槽横梁上，加样端位于负极，以双层滤纸联接琼脂板与电泳槽内缓冲液（槽内缓冲液为0.06M pH8.6巴比妥缓冲液）。接通电源，板端电压3v/cm，电流强度3mA/cm，电泳5小时。
6、结果判定（电泳结果示意图点击展开）
电泳毕，取出琼脂板，依次用生理盐水、蒸馏水浸泡后，加1%鞣酸冲洗琼脂板，晾干，即可观察与测定结果。也可以常规蛋白质染色法染色后观测结果。测定结果的方法有两种：一是测量沉淀峰的高度（自孔中央至峰尖），以mm计；另一是以求积仪测量沉淀峰的面积，以mm2计。前者较简便，后者较准确。根据测定的结果，从标准曲线中计算出待检标本中的抗原含量。
7、标准曲线制定
用上述选择好的最适浓度抗血清制备琼脂板。打孔，加入合适比例的5～10个标准抗原浓度，反复试验10次，取每次电泳后所测定的沉淀峰高度（或面积）的平均值，绘出标准曲线。
2014-05-26 23:17举报
